Vor 200 Jahren veränderte die Säkularisation den deutschen Südwesten: Nach den napoleonischen Kriegen gingen Gebäude, Ländereien und Vermögen der Klöster und Bistümer in staatlichen Besitz über. Die Auswirkungen reichen bis zum heutigen Tag - für die meist leer stehenden Gebäude mussten immer wieder neue Nutzungen gefunden werden. Auch das Deutschordensschloss Mergentheim war von der Aufhebung geistlicher Einrichtungen und der Übernahme kirchlichen Eigentums betroffen.
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Während der Säkularisation 1803 enteigneten württembergische Truppen das Deutschordensschloss. Zwei Jahre später gelangten „alle Besitzungen des Deutschordens in unsern Landen“ durch ein eigenmächtig erlassenes Dekret des württembergischen Kurfürsten in dessen Besitz. Im gleichen Jahr ordnete Napoleon jedoch den Ordensbesitz als Fürstentum Mergentheim einschließlich der Rechte und Einkünfte dem österreichischen Kaiser zu.
Mit der Auflösung des Deutschen Ordens 1809 erlosch nach 300 Jahren der höfische Glanz der Deutschordensresidenz. Seitdem befindet sich die Ordenszentrale in Wien. Kurz bevor Napoleon 1809 Mergentheim dem Königreich Württemberg zusprach, hatte „... Seine Majestät der König von Württemberg das Fürstentum Mergentheim mit allen seinen Zugehörungen militärisch okkupieren [...] lassen.“ Die Bevölkerung reagierte heftig: „Die württembergischen Truppen wurden entwaffnet; die württembergischen Wappen abgerissen...“ Der Aufstand wurde blutig niedergeschlagen.
Württemberg säkularisierte den gesamten Besitz des Deutschen Ordens in Mergentheim. Große Teile der wertvollen Bibliothek und der Inneneinrichtung wurden nach Stuttgart und Ludwigsburg ausgelagert. Die wechselhafte Nutzungsgeschichte begann: Ab 1827 wohnte Herzog Paul von Württemberg mit seiner Gemahlin im Schloss. Von seinen vielen Fernreisen brachte er zoologische, mineralogische und botanische Kostbarkeiten mit und stellte sie im Schloss aus. Einige von ihnen befinden sich heute im Stuttgarter Lindenmuseum. 1868 richtete man das Schloss als Kaserne für ein Jägerbataillon ein.
Während des Dritten Reiches nutzten lokale NS-Parteidienststellen die Gebäude. Unmittelbar nach dem Zweiten Weltkrieg richtete man eine Notunterkunft für im Krieg verschleppte Ausländer ein. Bis in die 60er Jahre gab es in den ehemaligen Schlossgemächern eine Kleiderfabrik. Auch Schulzimmer, die städtische Verwaltung, die Stadtbücherei, sogar eine Ballettschule waren hier untergebracht. Nach umfangreichen Sanierungsmaßnahmen 1996 steht das Schloss der Öffentlichkeit vollständig als Deutschordensmuseum zur Verfügung: Es befasst sich mit Geschichte, Kunst, Kultur und Wirken des Deutschen Ordens.